厌氧氨氧化基本原理是指在厌氧条件下，以NH⁴⁺-N为电子供体，NO^2--N为电子受体，直接将NH⁴⁺-N和NO^2--N转化为N₂的过程^[1].该反应最早是由Mulder等^[2]发现于反硝化流动床中，在反硝化工厂的脱氮反应进行氮平衡计算时，发现传统的硝化-反硝化不能解释其中大量的氮损失，因此推断这将是一种新型的厌氧脱氮反应.但众所周知，厌氧氨氧化菌生长非常缓慢，对细菌生长条件要求极为严格^[3]，如何缩短反应器启动时间，增加污泥活性逐渐成为研究的热点.

Chen^[4]等通过批次试验对添加Cu²⁺，Fe³⁺，Ni²⁺的厌氧氨氧化污泥活性进行考察，当Fe³⁺质量浓度达到36 mg/L时，厌氧氨氧化污泥量增长53.32%，在适当条件下，Fe³⁺，Cu²⁺和 Ni²⁺同时投加其容积氮去除率比对照反应器高52.8%.由此可见，金属离子对污泥活性有显著影响.现在，关于Fe²⁺对Anammox污泥活性的影响依然存在争议.

本文通过在实验反应器中添加不同浓度Fe²⁺并通过实验反应器与对照反应器氨氮去除率、酶活性、微生物形态等变化考察Fe²⁺对反应器脱氮效能的影响及其在厌氧氨氧化过程中作为电子供体/受体的潜在可能性.从而探索出能使厌氧氨氧化菌在有限条件下快速繁殖的方法，使厌氧氨氧化反应被广泛应用.

实验采用2个ASBR反应器(图 1)来考察不同浓度Fe²⁺对厌氧氨氧化菌脱氮性能的影响，装置采用有机玻璃制作，有效容积为2.0 L.内部装有改性生物膜载体，用聚乙烯网固定好后置于反应器内部，以便拆卸.装置表面用遮光布包裹，防止光线对污泥的负面影响.R1用作对照，控制 Fe²⁺浓度为0.035 mmol/L，R2用于实验，Fe²⁺浓度由0.035 mmol/L逐步增加至0.055，0.085 mmol/L.

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图 1 厌氧氨氧化反应器 Fig. 1 The reactor of anammox 1—氮气瓶； 2—进水箱； 3—蠕动泵； 4—ASBR反应器； 5—搅拌器； 6—排水箱； 7—气瓶； 8—排泥口.

用于接种的微生物取自于实验室已经稳定运行一年以上的厌氧氨氧化生物膜反应器内.人工配制废水主要含有亚硝态氮和氨氮以维持厌氧氨氧化生物活性.NH₄⁺-N和NO₂^--N分别用NH₄Cl和NaNO₂提供，浓度按需配置.其他成分为： KHCO₃ 500 mg/L，KH₂PO₄ 50 mg/L，EDTA 10 mg/L，KCl 1.4 mg/L，NaCl 1.0 mg/L，CaCl₂·H₂O 1.4 mg/L.不同浓度铁离子溶液由临时配制的FeSO₄·7H₂O溶液提供.反应器R1中Fe²⁺浓度为0.035 mmol/L，反应器R2中Fe²⁺浓度由0.035 mmol/L逐渐增至0.055，0.085 mmol/L.

指标测定方法按照《水和废水检测方法》^[5]，NH₄⁺-N采用纳氏分光光度法；NO₂^--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法；NO₃^- -N采用紫外分光光度法；铁离子浓度采用火焰原子吸收光谱法测定；pH值和DO采用WTW手提式多参数测定仪.

颗粒污泥扫描电镜观察的样品预处理方法如下：取适量颗粒污泥样品经戊二醛固定、缓冲液冲洗三次、乙酸戊酯置换、临界点干燥、离子溅射喷金处理后，使用Hitachi S-4700 型扫描电镜对样品进行观察并拍照^[6].

反应运行到第1,70,140,210 d时，每个反应器取出污泥样品1.5 g(干质量).污泥样品在4 ℃，9 000 r/min通过冷冻离心机离心10 min，之后用20 mmol，pH=7.0的磷酸钠缓冲液冲洗两次保存备用.冲洗后的小球重新悬浮在20 mL的缓冲液中，通过超声破碎仪冻融法使细胞溶解.之后细胞群通过22 000 r/min，4 ℃冷冻离心机离心4 min，上清液-20 ℃冷冻保存，以备用做蛋白质和酶活性测定时的细胞提取.蛋白质浓度测定依据Bradford ^[7]的程序.用BSA作为标准溶液.联氨脱氢酶的活性(HDH)测定依据文献^[8]的方法.用分光光度计在550 nm测试标准混合液时，可见反应的细胞色素碳吸收量有所增加.

在投加了一定量厌氧氨氧化污泥的反应器，通过逐步提高氮负荷的方式，考察厌氧氨氧化反应器的启动情况.待反应器稳定运行后考察不同浓度Fe²⁺对厌氧氨氧化反应器脱氮效能的影响.对照反应器(R1)中Fe²⁺浓度为0.035 mmol/L.根据投加不同浓度的金属离子(0.035，0.055，0.085 mmol/L)将反应器(R2)运行分为3个阶段，NH₄⁺-N，NO₂^--N变化分别见图 2.可以看出3个阶段的平均氨氮去除率分别为65.43%，80.60%和89.22%，平均亚硝态氮去除率分别为78.24%，81.23%和91.70%.氨氮和亚硝态氮的最大去除率均在Fe²⁺ 0.085 mmol/L时测得.这与文献^[9]经过71个周期培养，含Fe²⁺进水的厌氧氨氧化反应器R1脱氮效能由0.28 kg ·m^-3·d^-1升高到0.65 kg ·m^-3·d^-1一致.本研究出水中的硝态氮浓度与对照没有显著变化.

图 2(Figure 2)

Fig. 2

图 2 不同铁离子浓度下氮素转化情况 Fig. 2 The nitrogen transformation under different concentrations of iron ion

在厌氧氨氧化反应过程中，消耗的NO₂^--N与NH₄⁺-N理论值之比为1.32∶1，NO₃^--N生成量与NH₄⁺-N去除量之比为0.26∶1^[10].由图 3可以看出，反应器(R2)中氨氮和亚硝态氮的去除比例并不相同，三个阶段的平均值分别为1.26± 0.09，1.23 ± 0.03和1.19 ± 0.05，单边检测t(p5)显示其显著低于1.32，并且随Fe²⁺浓度的升高缓慢下降.反应产生的硝态氮与转化的氨氮比值没有显著变化.R1中，添加 Fe²⁺后，根据单边t检测，氨氮和亚硝态氮的去除比例均低于理论值1.32.

图 3(Figure 3)

Fig. 3

图 3 Nitrite与Ammonium的去除量比例和Nitrate 生成量与Ammonium去除量比例 Fig. 3 Conversion ratio of nitrite and ammonium and ratio between nitrate production and ammonium conversion

在实验运行到第1，70，140，210 d时分别检测了反应器内不同样品亚铁血红素C含量.在每个阶段亚铁血红素C含量和氨氮的去除率有直接关系.由图 4可见，在整个实验阶段，当反应进行到的第210 d时，样品中亚铁血红素C含量达到0.143 μmol/mg，是同期对照反应器的2.04倍.由此可见，Fe²⁺浓度直接影响细胞中亚铁血红素含量.

图 4(Figure 4)

Fig. 4

图 4 不同反应器内当Fe2+浓度为0.035，0.055，0.085 mmol/L时亚铁血红素C 含量 Fig. 4 The heme C content in different reactors when the concentration of Fe2 + was 0.035，0.055, 0.085 mmol/L

经过210 d的连续培养，对照和实验反应器内污泥样品的扫描电镜图片如图 5所示.从图 5可以看出，实验反应器R2中厌氧氨氧化菌群数量明显高于对照反应器.由图 5b可以看出厌氧氨氧化颗粒内部微生物排列紧密，并且可以清楚观察到，单个厌氧氨氧化菌的大小在0.8~1.0 μm，与现有文献报道的厌氧氨氧化菌的形态结构^[11]一致.这些均表明当Fe²⁺浓度为0.085 mmol/L时，反应器内厌氧氨氧化菌体结构和形态趋于稳定.

图 5(Figure 5)

Fig. 5

图 5 不同反应器内污泥SEM照片 Fig. 5 The SEM photos of different reactor sludges (a)—R1； (b)—R2.

铁是厌氧氨氧化微生物生长所必需的元素^[12].厌氧氨氧化菌富含血红素，它是能量代谢与细胞合成的重要电子载体^[13].Van Niftrik等^[12]认为，厌氧氨氧化菌吸收并且储存铁离子来满足血红蛋白的合成.这足以证明，铁离子在厌氧氨氧化反应过程中起了重要作用.因此假设添加Fe²⁺可以促进细胞血红素的合成，从而增强细菌的能量代谢.本文验证，当Fe²⁺浓度为0.085 mmol/L时，氮的转化率比浓度为0.035，0.055 mmol/L时明显增高,均保持在90%以上(图 2).

在厌氧条件下，氨氧化反应异化还原Fe²⁺的现象(铁氨氧化)已经在自然界中发现^[14].当铁离子浓度达到0.085 mmol/L时，NO₂^--N/NH₄⁺-N 的比值仍然小于 1.32，这可能和铁离子代替亚硝酸盐做电子供体有关，如图 3所示.这与文献^[13]验证的Fe²⁺可以作为这种菌的电子供体在还原硝酸盐过程中起关键作用相一致.

研究发现当Fe²⁺浓度提高到0.085 mmol/L时，氮的转化率均保持在90%以上.这为传统的厌氧氨氧化培养基配比提供了新的参考.更值得注意的是，本实验发现Fe²⁺不仅是厌氧氨氧化菌生长的必须元素，更是厌氧氨氧化过程中亚硝酸盐的电子供体.