微生物浸出技术是一种利用微生物自身的生命活动直接从矿石中提取有价金属元素的方法.由于该过程具有流程短、操作简单、反应过程温和、环境友好的优点及浸出速度慢、浸出周期长的缺点，与传统选冶方法相比，特别适合于贫矿、废矿、表外矿及难采、难选、难冶矿石的综合利用^[1].

菌种本身是微生物浸出技术的核心，高效浸矿菌种的选育是该技术应用的关键.嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，简称At.f菌)，是一种嗜酸、化能自养、专性好氧的革兰氏阴性菌，其作为微生物浸出技术应用的主要菌种之一，一直以来都是各国科研工作者研究的重点^{[2, 3]}.不同来源的At.f菌，其浸矿能力存在明显的差异，因此，研究不同地域、不同环境下的At.f菌的生物多样性和生态演替规律，对于高效浸矿菌种的选育具有重要意义^[4].

本文从西藏甲玛某多金属矿的矿坑水中分离提取了一株细菌，对其菌落和菌体的形貌特征及其生理特性进行了系统的研究，通过16S rRNA基因测序鉴定其为一株At.f菌.运用分离得到的At.f菌对西藏某低品位铜矿角岩矿进行了摇瓶浸出试验研究，考察其对该铜矿的浸出性能.

菌种是从西藏甲玛某多金属矿的酸性矿坑水(pH=3.5)中分离获得，命名为XZ菌.分离过程为：取5mL水样接种到100mL 9K液体培养基中，在30℃条件下振荡培养至颜色变为红棕色，重复该接种和培养过程5次.取最后一次的菌液，采用梯度稀释法在9K固体培养基中涂布，然后置于30℃生化培养箱中静置培养^{[2, 5]}.

液体培养基：选用9K培养基，其配方为(NH₄)₂SO₄ 3.0g/L，KCl 0.1g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，Ca(NO₃)₂ 0.01g/L，FeSO₄·7H₂O 44.2g/L^[2].其中，亚铁溶液采用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，基础盐溶液采用121℃高温灭菌，冷却后混合，并用灭菌的5mol/L硫酸溶液调节pH=2.0.

固体培养基：其配制方法是在9K液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂糖作为凝固剂，pH=2.0^[6].琼脂糖在酸性条件下高温加热易水解，故需单独灭菌后再进行混合配制.

离心收集培养至生长对数期的菌体，采用革兰氏染色方法对菌种进行染色处理，然后在生物显微镜(×1000，油镜)下观察菌种形态.另外，将收集到的菌体经过固定—脱水—置换—临界点干燥—离子溅射喷金等一系列特殊方法制样后，在扫描电镜下观察菌种的微观形貌.

将纯化后培养的菌液放入离心机中，2500r/min转速下离心10min以除去菌液中的沉淀杂质，然后进行菌体收集、基因组DNA的提取、16S rRNA扩增、基因测序及分析^{[7, 8]}.该项工作内容委托中国科学院沈阳应用生态研究所完成.

对亚铁的氧化能力是菌种活性的重要表现.在250mL锥形瓶中加入9K液体培养基90mL，接种对数期菌液10mL，在30℃恒温振荡器中培养，振荡强度为160r/min.培养过程中定期取样，采用重铬酸钾滴定法测量培养液中Fe²⁺的浓度，具体方法为：取1mL菌液，加入10mL硫磷混酸(V(H₂SO₄)∶V(H₃PO₄)∶V(H₂O)=15∶15∶70)，以2g/L二苯胺磺酸钠为指示剂，用1.7559g/L重铬酸钾标准溶液进行滴定.

Fe²⁺氧化率根据式(1)计算得到，其中，c_o和c分别为Fe²⁺初始浓度和实时测量浓度.以培养时间为横轴，以Fe²⁺氧化率为纵轴作图，即为细菌的亚铁氧化率曲线图.

菌种硫氧化活性测定采用的培养基是在无铁9K培养基中加入0.5g/L硫磺(CP)，接种和培养条件与亚铁氧化活性测定试验相同.定期测定菌液的pH值来表征该菌种的硫氧化活性.

试验用矿样为西藏甲玛地区某铜矿角岩矿，铜品位较低，仅为0.12%.矿石中的金属矿物主要为黄铁矿、辉铜矿、斑铜矿以及少量的黄铜矿和毒砂；脉石矿物主要为石英、钠长石等.矿石中的铜矿物含量较低，呈微粒嵌布，颗粒尺寸约为0.01~0.001mm，呈分散状充填于脉石矿物中.

矿石经破碎、研磨后使得粒级控制在-45μm占100% ，用于摇瓶浸出试验.试验条件为：250mL锥形瓶中加入9K培养基90mL，接种对数期菌液10mL，矿浆质量分数为10%，振荡强度为160r/min，培养温度为30℃.

试验过程中定期取样，采用ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪测定Cu²⁺的浓度，采用赛多利斯PB-10酸度计测量浸出环境的pH值.蒸发水用去离子水补充.

XZ菌接种到9K液体培养基中，随着培养时间的延长，培养液的颜色依次经历了“浅绿—浅黄—橙黄—橙红—深红—红棕”的变化过程，这是由于细菌在生命活动中不断将Fe²⁺氧化为Fe³⁺，以获得生命所需的能量.继续培养时会逐渐有大量黄色沉淀生成，沉淀经XRD鉴定为黄铵铁矾和黄钾铁矾的混合物，是溶液中高浓度的Fe³⁺在酸性条件下水解生成的产物.

XZ菌在9K固体培养基上生长十分缓慢.在30℃生化培养箱中培养20d后，XZ菌在固体培养基上生长形成了小而凸的圆形单菌落，直径1~1.5mm，具有不规则的边缘，呈棕黄色(见图 1).

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图 1 XZ菌的菌落形态 Fig. 1 The colonial morphology of strain XZ

XZ菌的菌体经革兰氏染色后呈红色，表明该菌属于革兰氏阴性菌；菌体形态单一，呈短杆状，长短略有差别，单生、对生均有(见图 2).从XZ菌的SEM照片(图 3)中可以看出菌体长度约为1～1.5μm，直径约0.5μm，两端钝圆.

图 2(Figure 2)

Fig. 2

图 2 XZ菌生物显微镜下形态 Fig. 2 Morphology of strain XZ under biomicroscope

图 3(Figure 3)

Fig. 3

图 3 XZ菌的SEM照片 Fig. 3 The SEM picture of strain XZ

通过对XZ菌生长的理化性质研究发现，该菌的最适宜生长温度为30℃，最适宜生长pH值为2.0，能够以Fe²⁺，黄铁矿(FeS₂)，S⁰，S₂O^2-₃作为能源物质生长，在单纯的葡萄糖培养基中无法生长.XZ菌生长的具体理化性质见表 1.

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 XZ菌生长的理化特征 Table 1 Physiological and biochemical feature of strain XZ 序号 理化特征 表现 1 革兰氏染色 G- 2 运动性 + 3 氧化 Fe2+，FeS2 + 4 氧化 S0，S2O2-3 + 5 异养生长(葡萄糖) - 6 严格好氧 + 7 最适生长温度/℃ 30 8 最适生长pH值 2.0

表 1 XZ菌生长的理化特征 Table 1 Physiological and biochemical feature of strain XZ

从培养收集到的XZ菌体中提取基因组，采用PCR技术扩增出16S rRNA，然后进行克隆和测序，将XZ菌的16S rRNA序列与GenBank中已知序列进行比对，结果表明，其与嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)的多个Acidithiobacillus ferrooxidans菌株的序列相似性均达到99%以上(见图 4).鉴定结果表明，XZ菌是一株生活在西藏高寒地区的At.f菌株.该菌株的分离为研究At.f菌物种和地域分布的多样性提供了新的资料，对浸矿细菌的遗传分类学研究具有一定的意义.

图 4(Figure 4)

Fig. 4

图 4 XZ菌的16S rRNA序列系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree derived from 16S rRNA sequence of strain XZ

At.f菌能够以Fe²⁺为能源物质，在生长过程中通过将Fe²⁺氧化成Fe³⁺来获得生长所需的能量^[9]，其氧化机理如式(2)所示.

从图 5中可以看出，从酸性矿坑水中提取的未经活化的细菌对Fe²⁺的氧化活性较差，培养过程中完全氧化9K液体培养基中的Fe²⁺需要 100h.而分离纯化后，经过连续五代的活化培养后，只需50h即可将培养基中的Fe²⁺完全氧化，氧化活性得到显著的提高.从图 5中还可以看出，培养前期，细菌生长存在一定的停滞期，随着培养时间的增长，细菌逐渐适应了环境而加快增殖的速度，使得培养液中的菌体浓度指数级迅速增大，从而使Fe²⁺的氧化率也随之呈指数级增长.

图 5(Figure 5)

Fig. 5

图 5 XZ菌的亚铁氧化率曲线 Fig. 5 Ferrous ion oxidation rate curves of strain XZ

At.f菌能够以单质硫为能源物质，在生长过程中通过将单质硫氧化成硫酸来获得生长所需的能量，并使得培养基的pH值不断降低^[9]，其氧化机理如式(3)所示.

从图 6中看出，XZ菌氧化单质硫的过程比氧化亚铁时间长很多，且活化培养能够明显提高 XZ菌的硫氧化活性.原始菌在接种后的 0～3d

图 6(Figure 6)

Fig. 6

图 6 XZ菌的硫氧化过程中pH变化曲线 Fig. 6 Variation of pH value in sulfur oxidation process of strain XZ

对单质硫的氧化速度缓慢，细菌处于生长延滞期；在3～20d时，细菌逐渐适应环境，开始迅速生长，氧化速率快速提高，溶液pH值快速下降到1.0；20d后随着单质硫的逐渐氧化完全，pH值逐渐恒定.活化后的XZ菌在接种后几乎没有延滞期，单质硫迅速被氧化，溶液pH值在15d时迅速下降到1.0，表现出较强的硫氧化活性.

从图 7中可以看出，摇瓶浸矿体系下，在浸出初始阶段，Cu²⁺的浸出速度较快，这是由于矿样经破碎研磨后，大量含铜矿物的晶格暴露在固体颗粒外表面，与细菌接触充分，有利于Cu²⁺的氧化浸出；随着浸出过程的进行，暴露的铜矿物晶格减少，加之Fe³⁺水解产生的铁矾沉淀的罩盖作用影响，使得细菌与矿物的氧化作用不能顺利进行，Cu²⁺的浸出速率逐渐降低^[10].浸出15d时，Cu²⁺的浸出率可达72.15%，表明分离得到的XZ菌对该低品位铜矿具有较强的浸出作用.

图 7(Figure 7)

Fig. 7

图 7 Cu2+的浸出率及pH变化曲线 Fig. 7 Variation curves of copper ion leaching rate and pH value

从图 7中还可以看出，在浸出初始阶段，随着矿样的加入，浸液的pH值有所升高，这是矿样中含有一定量的氧化矿物消耗酸所致.随着时间的延长，浸矿细菌不断增殖，对矿石中的黄铁矿、辉铜矿、斑铜矿和黄铜矿等硫化矿物的生物氧化作用逐渐增强，细菌的氧化作用和Fe³⁺的水解作用产酸，导致浸出体系中的pH值不断降低.

1) 从西藏甲玛某多金属矿的酸性矿坑水中分离得到一株细菌XZ，为革兰氏阴性菌，短杆状，菌体长约1～1.5μm，直径约0.5μm，根据其形貌特征、理化特性及16S rRNA测序鉴定其为一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌.

2) 对XZ菌进行了亚铁和单质硫的氧化活性测试，结果表明，该菌在接种到9K液体培养基中，接种量(体积分数)为10%，经过50h即可将Fe²⁺氧化完全，具有较强的亚铁氧化活性；相比而言，XZ菌对单质硫的氧化要慢得多，但依然表现出较强的硫氧化活性.

3) 利用获得的XZ菌对西藏某低品位铜矿角岩矿进行了摇瓶浸出试验.在接种量(体积分数)为10%，矿浆质量分数为10%，矿石粒度为-45μm占100%，培养温度30℃，振荡强度160r/min的条件下，浸出15d，Cu²⁺浸出率达72.15%，表明XZ菌对该矿具有较强的浸出能力.