微生物絮凝剂(microbial flocculant，MBF)是具有絮凝活性的微生物代谢产物^[1].它们一般由多糖、蛋白质、糖蛋白、核酸等高分子物质构成^[2]，分子量一般大于1×10⁵ Da.相对于无机絮凝剂和有机合成絮凝剂，微生物絮凝剂具有无毒、可生物降解及无二次污染等特点^[3]，使其更适合应用在饮用水和污水处理^{[4, 5]}、食品和发酵产业的下游工序中^[6].研究发现能够产生絮凝剂的微生物种类繁多，包括细菌、放线菌、真菌、霉菌、酵母菌和某些藻类等.这些微生物资源丰富，广泛分布在土壤、沉积物、活性污泥及污水中.但存在生产成本较高、发酵工艺不成熟和絮凝效果不稳定等问题，限制了微生物絮凝剂的发展.因此，筛选高效稳定的絮凝剂产生菌，提高产品的稳定性是微生物絮凝剂的发展趋势之一.

类芽孢杆菌属最初是由Ash等基于16S rRNA基因序列将一些菌株从芽孢杆菌属中划分出来的^[7].随后从土壤、植物的根和食物等不同的环境样品中分离出很多该属的菌株^[8].由于该属的菌株具有固氮、降解纤维素和木聚糖、产生强抗菌化合物等功能^{[9, 10, 11]}，类芽孢杆菌已成为近年来的研究热点.本研究从土壤中分离得到一株絮凝剂产生菌XHUA9，对菌株形态、生理生化特征、细胞化学组分、(G + C) 摩尔分数、基因组DNA-DNA同源性及16S rRNA基因序列等进行了研究.同时将菌株XHUA9的发酵产物进行分离提纯，并利用紫外和红外光谱检测其主要组成成分.

XHUA9筛选自一棵桃树下的土壤样本，用牛肉膏蛋白胨培养基，采用稀释法分离.保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(CGMCC NO.2040).实验中选取模式菌株Paenibacillus hunanensis FeL05^T作为对照菌.筛选培养基组成为: 葡萄糖 1.0 g，KH₂PO₄ 0.2 g，K₂HPO₄ 0.5 g，酵母膏 0.5 g，脲 0.05 g，MgSO₄·7H₂O 0.02 g，NaCl 0.01 g，蒸馏水 100 mL,pH=7.0.在三角瓶中装入 100 mL培养基并灭菌，然后接入菌种，在 30 ℃和150 r/min的条件下培养30 h，测定培养液絮凝率.

实验所用试剂均为分析纯.

主要仪器包括电子天平(FA1004，上海舜宇)、扫描电镜(SSX-550，岛津)、冷冻离心机(5424R，eppendorf)、PCR扩增仪(2720，美国ABI)、紫外分光光度计(759，上海菁华)、红外光谱仪(Nicolet 380,美国)、恒温振荡器(TS-100B，上海天呈)、高压灭菌锅(YXQ-LS-50SII，上海博迅)、超净工作台(SW-CJ-1FD，上海博迅)等.

在100 mL高岭土悬浮液(5 g/L)中加入0.1 mL菌株培养液，空白对照中不加培养液，静置5 min后测定上清液光密度OD₅₅₀.絮凝率计算公式为

E = (OD₅₅₀-OD′₅₅₀) / OD₅₅₀ × 100%.

其中:OD₅₅₀ 为未加培养液前550 nm 处光密度值；OD′₅₅₀为加入培养液5 min后550 nm 处光密度值.

将培养液稀释10倍，高速离心去除菌体，然后用旋转蒸发器浓缩(50～60 ℃)至原体积，加入2倍体积的预冷乙醇，离心收集沉淀，再将沉淀溶于水，加0.5倍氯仿和正丁醇混合液去除游离蛋白，然后将上清液透析，并用乙醇沉淀，最后真空冷冻干燥得到絮凝剂精品.分别用紫外扫描、蛋白特征反应、Molish和蒽酮呈色反应检测产物中是否含有蛋白质、核酸和糖类，并用红外光谱仪分析产物中的特征基团.

光学显微镜下观察菌体形态，扫描电子显微镜下观察菌体表面结构和有无内生孢子；采用革兰氏染色；利用API 50 CHB,API 20E (BioMerieux)试剂盒及GP2鉴定板(Biolog) (方法参照公司说明书)对菌株进行唯一碳源利用及酶学特性等生理生化指标鉴定.

脂肪酸组分分析使用美国MIDI公司的Sherolock全自动细菌鉴定系统(Sherolock Version 6.0)；极性脂肪酸通过二维薄层层析提取和分离，并喷洒检测试剂鉴定；细胞甲基萘醌采用Collins的方法分离提纯^[12]，并用高效液相色谱分析法测定.

采用高效液相色谱法测定菌株(G + C) 摩尔分数；采用微孔板杂交法测定菌株和模式菌株间基因组DNA-DNA同源性；16S rRNA基因序列分析：扩增用上下游引物分别为BSF 8/27 (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和BSR 1525/1541 (5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’).以菌株XHUA9的基因组为模板进行 PCR扩增.反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循环 35 次；72 ℃ 30 min.用TaKaRa公司回收试剂盒回收 PCR扩增产物，送生物公司测序.将测序得到的序列在NCBI的网站上进行比对，并用软件MEGA构建系统发育树^[13].

XHUA9菌株为长杆状(见图 1a)，(4.16~4.83)×0.83 μm，好氧，能形成芽孢，革兰氏染色阳性.菌株 30 ℃ 下平板培养，其菌落呈圆形、表面光滑，较黏，凸起很高，为浅黄棕色并透明 (见图 1b).

图1(Figure 1)

图1 菌株XHUA9的细胞形态及菌落 Fig. 1 Morphology and colony of the strain XHUA9 (a)—细胞形态； (b)—菌落.

菌株XHUA9和模式菌株FeL05^T生理生化实验结果见表 1，表中YQ1是课题组筛选的另一株类芽孢杆菌.从表 1可以看出,菌株XHUA9和FeL05^T主要生理生化指标较一致，个别指标上存在不同.

表1(Table 1)

表1 XHUA9的生理生化实验结果 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain XHUA9 实验项目 XHUA9 YQ1 FeL05T 荚膜 + + + 革兰氏染色 + + + 氧化酶 - - - 伏-普 + + + 硝酸盐还原 + + + 明胶水解 - - - 淀粉水解 + + + 生长温度50 ℃ - - - pH 5.6 + + + DNA(G+C)摩尔分数/% 51.9 51.9 53.3 碳源利用 L-鼠李糖 w w - D-麦芽糖 + + + D-果糖-6-磷酸 w w + 蔗糖 + + + 葡糖醛酰胺 - w w 四唑蓝 - - - 乙酸 w w - 氨曲南 - - w 乙酰乙酸 - w w D-半乳糖醛酸 + - + L- 苹果酸 - - w L-岩藻糖 - - - D-果糖 + + + L-乳酸 w - - 柠檬酸 - - - D-苹果酸 - - - 肌苷 + + + D-棉子糖 + w + Tween 80 - - + D- 葡萄糖醛酸 - - w α-酮戊二酸 - - - 丁酸钠 + + + 甲酸 - - w 四氮唑紫 w w - 奎宁酸 - - - 糊精 + + + L-丙氨酸 - - - 糊精糖 + + + L- 谷氨酸 - - - 松二糖 + + + L-丝氨酸 - - - 注：+为阳性或存在；w为弱阳性；-为阴性或缺失.

表1 XHUA9的生理生化实验结果 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain XHUA9

菌株XHUA9主要脂肪酸为anteiso-C_15:0,C_16:0,iso-C_15:0,anteiso-C_17:0,iso-C_16:0和iso-C_17:0；菌株XHUA9主要极性脂肪酸为双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)，菌株XHUA9和FeL05^T的极性脂肪酸检测结果见图 2；菌株XHUA9和FeL05^T的甲基萘醌均为MK-7.

图2(Figure 2)

图2 菌株XHUA9和FeL05T的极性脂肪酸检测结果 Fig. 2 Polar lipid profile of strain XHUA9 and FeL05T

不同微生物的脂肪酸在质量分数和组成上差异较大，它和微生物耐药性、遗传变异等关系密切^[14].不同微生物具有不同种类的醌，它是微生物能量代谢过程中的电子传递体.微生物醌主要有两种类型：甲基萘醌(简写为MK，即2-甲基-3-多异戊烯基-1,4-萘醌)和泛醌(简写为Q，即2,3-二甲氧基-5-甲基-6多异戊烯基-l,4-苯醌).醌的异戊烯基侧链长度和氢的饱和度不同，可以为不同微生物属的分类提供依据.革兰氏阳性细菌主要合成甲基萘醌.经对比发现，菌株XHUA9和FeL05^T的主要脂肪酸相同，质量分数相差不大；主要极性脂肪酸存在差异，菌株XHUA9和FeL05^T均含有双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)，此外，FeL05^T还含有氨基脂(AL)和磷脂(PL)；菌株XHUA9和FeL05^T的甲基萘醌相同.

微生物DNA碱基组成具有种特异性，DNA的(G+C)值在细胞中很稳定，可以作为细菌鉴定重要遗传指标，而且它不受菌龄及突变因素以外的其他因素影响.菌株XHUA9的(G + C) 摩尔分数为51.9%.

许多资料表明，DNA-DNA杂交最适合于微生物种一级水平的研究.DNA-DNA杂交同源性在低于20%的菌株为不同属的关系，同源性在60%以上者可视为同一个种，而同源性在20%~30%之间的菌株应为属内关系紧密的种.菌株XHUA9和模式菌株FeL05^T间基因组DNA-DNA同源性杂交值为51.6%，这个值在30%~60%之间，说明菌株XHUA9和Paenibacillus hunanensis是类芽孢杆菌属内亲缘关系较近的种.

采用细菌通用引物对菌株XHUA9 的16S rRNA基因序列进行测序，得到目标序列长度为1 426 kb.其 16S rRNA基因序列的 GenBank登录号为KF834270.用得到的序列在 GenBank数据库中进行Blasten检索，结果表明菌株XHUA9与YQ1,Paenibacillus hunanensis FeL05^T和Paenibacillus kribbensis AM49^T序列同源性分别达到 99%，96.7%和94%.采用软件MEGA4.1中 Neighbor-joining法构建16S rRNA序列系统发育树，结果发现菌株XHUA9和课题组筛选的另一菌株YQ1聚为一簇 (见图 3)，表明它们的亲缘关系最近.

图3(Figure 3)

图3 菌株XHUA9的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of strain XHUA9

经絮凝活性测定，菌株XHUA9所产絮凝剂处理高岭土悬浮液，絮凝率高达 97 %，用量少，且不需添加 Ca²⁺,Al³⁺等作为助凝剂.用蒸馏水溶解絮凝剂提纯产物，在200~400 nm波长下进行紫外扫描，得到的扫描图中没有出现蛋白质和核酸的吸收峰，说明提纯产物不含蛋白质和核酸.双缩脲反应、茚三酮反应和蛋白黄色反应都无颜色变化，进一步表明提纯产物中不含蛋白质.在Molish 反应中有紫环生成，而蒽酮反应呈现蓝绿色，说明产物中有糖的成分.

菌株XHUA9产生絮凝剂的红外光谱图具有典型的多糖特征吸收峰(见图 4).特征吸收峰为3 475.18，2 924.49，1 666.20，1 622.94，1 358.42，1 004.12 cm^-1.3 475.18 cm^-1处宽吸收峰是糖分子内或糖分子间的氢键O—H伸缩振动的结果；2 924.49 cm^-1处小吸收峰为 C—H不对称伸缩振动的结果，此区域的吸收峰是糖类的特征；1 666.20 cm^-1处吸收峰是CO键伸缩振动偏移的结果；1 622.94 cm^-1处吸收峰是CC键伸缩振动的结果；1 358.42 cm^-1吸收峰是C—H的变角振动；1 000~1 200 cm^-1间吸收峰是C—O伸缩振动.通过红外光谱分析，得出菌株XHUA9所产絮凝剂的主要成分为多糖类物质.

图4(Figure 4)

图4 絮凝菌XHUA9产生絮凝剂的红外光谱图 Fig. 4 Infrared ray spectrum of bioflocculant produced by XHUA9

1) 根据形态学特征、生理生化特征、细胞化学组分、分子生物学等多相分类鉴定结果，菌株XHUA9被鉴定为类芽孢杆菌属内的新种.

2) 菌株XHUA9所产絮凝剂不需添加 Ca²⁺，Al³⁺等作为助凝剂，且絮凝活性高、用量少，在微生物絮凝剂的开发和利用上具有一定的研究价值.

3) 紫外扫描、红外光谱、蛋白质和糖类的颜色反应等分析结果表明，菌株XHUA9所产絮凝剂的主要成分为多糖类物质.