2017, Vol. 38
2. 东北大学 冶金学院, 辽宁 沈阳 110819
2. School of Metallurgy, Northeastern University, Shenyang 110819, China
油页岩属于极端环境, 蕴含独特的微生物资源, 尚未被充分了解与利用.间接证据表明, 微生物在油页岩的沉积和早期地质形成中起到了至关重要的作用[1].这个过程伴随着原始微生物群落的形成.先前用克隆文库方法对我国主要油页岩矿的细菌和真菌群落进行了调查, 发现超过50%的细菌和1.1%~13.5%的真菌为未被鉴定种属[2-3], 表明经过漫长复杂的地质演化, 在油页岩中逐渐形成了与其环境相适应的特有微生物类群.还有研究证实, 不同类型页岩中存在需氧和厌氧的异养微生物(如硫酸盐还原菌和发酵菌)、化能自养微生物(如硫细菌和氧化铁细菌)和产甲烷古细菌等[4].此外, 有关页岩微生物降解其有机质的研究尚在起步阶段[5-7].总体上人们对油页岩微生物的认识与利用仍相当有限, 尤其在古细菌方面.通常古细菌都是严格厌氧菌, 能被培养的古细菌仅占很少的一部分, 且培养条件苛刻, 因而要了解其在环境中的分布和数量较为困难.
FISH技术是一种非放射性的荧光原位杂交技术, 可快速准确直观地反映出环境微生物群落的原位分布、形态和相对数量等生态特征, 已成为环境微生物检测的强有力工具.本实验用FISH技术调查我国主要油页岩矿区(辽宁抚顺、吉林桦甸和广东茂名)的细菌和古细菌的相对丰度及空间分布, 有效避免了微生物培养、DNA抽提和PCR扩增带来的偏差, 是对我国油页岩环境中微生物资源现状的有益补充, 也为油页岩的生物开发利用提供必要的生态学背景.
1 实验材料和方法 1.1 实验材料样品采自辽宁抚顺(41°50′ N, 123° 57′ E)、吉林桦甸(43°00′ N, 126°47′ E)和广东茂名(21°41′ N, 110°58′ E)油页岩矿.每矿采集3种样品:抚顺矿和茂名矿为露天开采矿, 采集新鲜油页岩(依次为FX和MX)、风化油页岩(依次为FF和MF)和矿区内砂土(依次为FT和MT); 桦甸矿为井下开采矿, 无风化油页岩, 因此采集新鲜油页岩(HX)、矿区砂土(HT)和与被采集油页岩层紧邻的砂砾岩(HS).每个样品采集3个重复, 采样地大小为20 m×20 m, 间隔约500~1 000 m.采样时去掉表层2 ~ 10 cm, 用多点取样法采样.每个点取约等量样品, 于取样桶内混匀后过4 mm筛子, 四分法取适量装入50 mL无菌离心管, 低温保存带回实验室.所用器具均经高压蒸汽灭菌后烘干使用.实验所用探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成.EUB338(细菌探针):5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’, 5’标记异硫氰酸盐荧光素(FITC), 其吸收波长为492 nm, 发射波长为528 nm; ARCH915(古细菌探针):5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’, 5’标记花青3(CY3), 其吸收波长为550 nm, 发射波长为570 nm[8].
1.2 实验方法 1.2.1 杂交方法1) 菌体收集: 20 g样品加入100 mL PBS (8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4, 1.56 g Na2HPO4·2H2O定容至1 L)中, 160 r·min-1振荡30 min, 加入500 μL的100 mg·mL-1溶菌酶继续振荡30 min; 600 r·min-1离心5 min, 将上清液13 000 r·min-1离心15 min, 合并两次沉淀; 将沉淀重悬于3 mL PBS中, 加入等体积质量分数为60%的Nycodenz密度梯度分离液, 4 ℃下，12 000 r·min-1离心40 min, 收集上清液和中层菌体; 4 ℃ 12 000 r·min-1离心40 min, 收集菌体沉淀; 调整菌液浓度, 使OD600约为1.0.
2) 载玻片处理: 2 g明胶加入500 mL水中, 加热溶解, 将灭菌的洁净载玻片放入明胶溶液中浸泡10 min, 60 ℃烘干2 h, 制成明胶载玻片.
3) 多聚甲醛固定:将步骤1) 的菌液用3倍以上体积分数为4%的多聚甲醛4 ℃固定过夜, 12 000 r·min-1离心10 min, 收集菌体.PBS清洗菌体, 12 000 r·min-1离心10 min, 收集菌体, 重复3次.将收集的菌体重悬在PBS中, 4 ℃保存.
4) 样品预处理:取20 μL步骤3) 的菌液涂于步骤2) 的明胶载玻片上, 自然风干; 样品预处理参照1.2.2节; 于-20 ℃预冷的50%, 80%和100%乙醇中依次脱水3 min, 自然风干.
5) 杂交反应:20 μL探针杂交液(含0.02 mol·L-1 Tris-HCl, 0.1%的SDS, 0.9 mol·L-1 NaCl, 去离子甲酰胺)体系中探针各2 μL(50 ng·μL-1)加在步骤4) 样品上并封片, 恒温避光杂交.杂交温度、时间和探针杂交液中去离子甲酰胺浓度参照1.2.3节.
6) 杂交后洗脱:将载玻片于48 ℃预热的50%甲酰胺/2×SSC溶液(50 mL去离子甲酰胺, 10 mL 20×SSC定容至100 mL; 20×SSC:17.6 g NaCl, 8.8 g C6H5O7Na3·2H2O, 调pH至7.2后定容至100 mL)中洗涤10 min×3次; 再于48 ℃预热的SSC (20×SSC稀释20倍)中洗涤10 min×3次; 纯水清洗后自然风干.步骤6) 与步骤7) 需避光.
7) DAPI染色: 60 μL DAPI染液加在载玻片样品上, 染色3 ~ 5 min; PBS洗涤3 min×2次, 纯水清洗后自然风干; 加10 μL抗荧光淬灭封片液封片后于倒置荧光显微镜(Leica, 德国)下1 000倍镜检.
1.2.2 样品预处理方式优化设置2组实验条件进行比对:一组为溶菌酶(10 mg·mL-1) 37 ℃处理30 min; 另一组为100 μL TRIzol试剂常温处理5 min后再溶菌酶(10 mg·mL-1) 37 ℃处理30 min.
1.2.3 杂交温度、杂交时间和去离子甲酰胺浓度优化在文献[9]基础上进行杂交温度、杂交时间和去离子甲酰胺浓度等杂交条件优化, 见表 1.
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表 1 杂交条件优化 Table 1 Optimization of hybridization conditions |
实验样品为抚顺矿FX, FF, FT; 桦甸矿HX, HS, HT; 茂名矿MX, MF, MT.
方法同1.2.1, 样品预处理方式采用100 μL TRIzol试剂常温处理5 min后再溶菌酶(10 mg·mL-1) 37 ℃处理30 min, 杂交温度为46 ℃, 杂交时间为2.5 h, 杂交液中去离子甲酰胺的体积分数为20%.
每个样品随机观察10个视野×3个平行, 记录视野中细菌数、古细菌数和全菌数.每个样品细菌相对丰度(P1)、古细菌相对丰度(P2)及除细菌和古细菌外其他菌相对丰度(P3)的计算式分别为
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(1) |
式中: Aa, Ab和A分别为细菌、古细菌和全菌的数目, 其计算式为
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(2) |
式中：Aj表示细菌、古细菌或全菌的3个平行样品的平均数目, j代表细菌、古细菌或全菌; A1~A3为细菌、古细菌或全菌的3个平行样品的数目.A1~A3的计算式为
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(3) |
式中:ai1~ai10为第i个平行样品的10个视野中记录的细菌数、古细菌数或全菌数.
2 结果与讨论 2.1 样品预处理方式优化利用FISH检测不同类群微生物时, 所使用的特异性探针、样品中微生物细胞壁的松弛程度及细胞内靶核酸结合探针的能力均各不相同, 且杂交时靶核酸与探针不要求完全互补, 有限数目非互补碱基对的存在并不影响杂交的发生, 加之杂交的专一性和严格性依赖于杂交的盐浓度、温度和时间等, 因此通常需要对杂交条件进行优化.本实验在同样条件下, 用溶菌酶37 ℃处理30 min (图 1a)与用TRIzol常温处理5 min后再溶菌酶37 ℃处理30 min (图 1b)相比, 这两种样品预处理方式的杂交效果差异明显:前者杂交率较低, 仅约20%, 且荧光亮度明暗不一(图 1a-FITC, 同一样品DAPI染色表征全部微生物, FITC染色表征细菌); 而后者杂交率提高到约40% (图 1b-FITC, 同一样品DAPI染色表征全部微生物, FITC染色表征细菌).可见, TRIzol和溶菌酶共处理方式能够明显提高探针与靶核酸的杂交率.
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图 1 样品预处理方式的影响 Fig.1 Effect of sample pretreatment (a)—溶菌酶37 ℃作用30 min；(b)—TRIzol作用5 min后溶菌酶37 ℃作用30 min. |
当杂交温度为42 ℃ (图 2)和50 ℃(图 3)时, 各组比对实验的杂交效果均不理想, 杂交率分别低于50%和30%, 且荧光亮度均明暗不一.当杂交温度为46 ℃时(图 4), 各组比对实验均取得了较好的效果, 与42 ℃和50 ℃相比, 杂交率明显提高, 荧光亮度明显增强.这说明该温度有利于探针进入细胞内与靶核酸结合, 特别是杂交时间2.5 h、杂交液中去离子甲酰胺体积分数为20%时, 杂交率接近100% (图 4中组4), 且荧光亮度明亮均匀, 是一组较理想的杂交条件.
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图 2 杂交温度为42 ℃ Fig.2 Hybridization temperature at 42 ℃ 组1—3 h, 去离子甲酰胺体积分数为30%；组2—2 h, 去离子甲酰胺体积分数为20%. |
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图 3 杂交温度为50 ℃ Fig.3 Hybridization temperature at 50 ℃ 组6—2 h, 去离子甲酰胺体积分数为25%；组7—2.5 h, 去离子甲酰胺体积分数为20%. |
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图 4 杂交温度为46 ℃ Fig.4 Hybridization temperature at 46 ℃ 组3—2 h, 去离子甲酰胺体积分数为30%；组4—2.5 h, 去离子甲酰胺体积分数为20%;组5 3 h, 去离子甲酰胺体积分数为40%. |
除温度外, 杂交时间和杂交液中去离子甲酰胺的体积分数也是影响杂交反应的关键因素.杂交时间过短会造成杂交不完全(图 4中组3), 杂交时间过长会增加碱基错配几率和增大荧光背景, 影响荧光信号检测(图 4中组5).杂交温度通常在37~50 ℃之间, 根据探针不同具体温度有一定差异, 但若超过50 ℃, 对于保持细胞形态完整和维持细胞粘附于载玻片都较为困难.另外, 杂交液中添加适宜体积分数的去离子甲酰胺可以在降低杂交反应温度的同时, 提高杂交特异性.
2.3 FISH检测油页岩中细菌和古细菌相对丰度基于上面的优化条件, 用DAPI表征微生物总数, EUB338/DAPI和ARCH915/DAPI分别表征样品中细菌和古细菌占微生物总数的比例, 即相对丰度.图 5是以新鲜油页岩样品为例的全菌染色与使用上述两种探针的FISH叠加图像.细菌为青色, 因为目标生物类群为细菌的探针EUB338, 其5’端标记的荧光染料FITC呈绿色, 荧光染料DAPI呈蓝色, 二者叠加后呈现青色; 同理古细菌为粉色, 因为目标生物类群为古细菌的探针ARCH915, 其5′端标记的荧光染料CY3呈红色, 荧光染料DAPI呈蓝色, 二者叠加后呈现粉色; 除细菌和古细菌之外的微生物依然为DAPI的蓝色; 而亮黄色等大块荧光物质为杂质.
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图 5 新鲜油页岩样品的FISH图 Fig.5 FISH image of freshly mined oil-shale sample |
图 6为各样品细菌(P1)、古细菌(P2)和除这两者外其他菌(P3)的相对丰度.对于细菌, 首先, 所有样品中细菌相对丰度均在50%以上, 说明在不同矿区、不同类型样品的微生物群落中, 细菌都是数量上占绝对优势的类群; 由文献[2, 10]可知, 茂名矿各样品, 尤其是MT和MF, 细菌多样性与其他样品相比较差, 且其含水量(4.83% ~ 5.09%)和pH值(3.14 ~ 4.79) 均较低, 从传统纯培养角度看并不适宜细菌生长繁殖, 即便如此, 其群落中依然有五成以上为细菌类群, 说明细菌的生存适应能力更强.第二, 对于每一矿的3种类型样品, 新鲜油页岩的细菌相对丰度均最高, 明显高于同矿砂土和风化油页岩或砂砾岩, 这可能与新鲜油页岩中营养成分和能量来源相对最丰富有关.第三, 抚顺矿各样品细菌相对丰度较其他两矿低, 除FX为61.77%外, 该矿其他样品仅为50%左右; 而桦甸矿各样品均在60%~70%, 且分布差异不大.
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图 6 油页岩样品中微生物的相对丰度 Fig.6 Relative abundances of microbes in oil-shale samples |
对于古细菌, 首先, 所有样品中古细菌相对丰度均在5%以下, 说明在不同矿区、不同类型样品中古细菌均为劣势类群.第二, 对于每一矿的3种类型样品, 与细菌结果类似, 新鲜油页岩的古细菌相对丰度均最高, 其次是风化油页岩或砂砾岩, 砂土最低, 说明古细菌与细菌一样, 对新鲜油页岩具有最好的利用能力.第三, 与细菌结果相反, 抚顺矿各样品古细菌相对丰度较高, 在0.2%~4.6%范围内, 其中FF高达2.25%, FX更高达4.53%;而桦甸矿各样品古细菌相对丰度较其他两矿低, 除HX为0.33%外, 该矿其他样品中古细菌所占比例极低(HS)或根本无法检出(HT).
3 结论1) 杂交温度46 ℃、杂交时间2.5 h、杂交液中去离子甲酰胺的体积分数为20%时, TRIzol和溶菌酶共处理, 杂交率接近100%, 荧光亮度明亮均匀, 是一组较理想的油页岩微生物的FISH杂交反应条件.
2) 各矿所有样品中, 细菌相对丰度均在50%以上, 新鲜油页岩细菌相对丰度最高.桦甸矿细菌相对丰度最高, 其次茂名矿, 抚顺矿最低.
3) 各矿所有样品中, 古细菌相对丰度均在5%以下, 其中新鲜油页岩中古细菌相对丰度最高, 其次是风化油页岩或砂砾岩, 砂土最低.抚顺矿古细菌相对丰度最高, 其次茂名矿, 桦甸矿最低.
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