生物电化学系统(bioelectrochemical system,BES)将微生物催化和电化学作用结合，在能源生产和污染物处理领域得到了充分的关注.在初始的研究阶段，其主要的作用是利用污水中可利用的底物生产电能，即微生物燃料电池(microbial fuel cell,MFC).底物在阳极电化学活性细菌的作用下被氧化产生电子，电子传递到阳极通过外电路达到阴极，被阴极的氧气等电子受体接受.由于阴极的电势远远高于阳极，所以产生电势差使电子流动产生电流.如果人为地施加一个外加电压至阴阳极两端，造成阴极电位低于质子还原电位，氢气则由于还原作用从阴极产生，这种制氢技术被称作微生物电解池(microbial electrolysis cell,MEC) .随着更多研究的深入，大量的难降解污染物被发现可以在阴极被还原降解，包括硝基苯、偶氮染料、含氯化合物、重金属等多种污染物.

BES的工作基础在于阳极生物膜高效的电化学活性，其主要作用是氧化底物产生电子，然后通过胞外电子传递至阳极.由大量种类繁多的电化学活性细菌所构成的阳极生物膜的催化作用都是BES稳定运行的关键，所以了解阳极生物膜群落的结构与功能，对更深入地开展BES的应用是非常必要的.

对于微生物群落构成的研究方法有很多种，包括多种的生化指标分析、16S rRNA文库构建和PCR-DGGE等方法^{[1, 2]}.这些传统的分子生物学方法效率比较低下，不能有效地、系统地反映群落的丰度和多样性.高通量测序技术是近年国际流行的对微生物群落进行群落结构分析的方法，其能读取出上万核酸片段的信息，测序结果通过与数据库中已有数据进行比对，大多数序列都可以鉴定到属或种^{[3, 4]}.针对BES的阳极生物膜，利用高通量测序技术，深入地分析了微生物种类、结构和功能，有助于揭示其中起着重要作用的微生物，为BES的长期稳定运行提供理论依据.

阳极生物膜接种物采用本实验室之前的BES阳极室出水，以乙酸盐作为底物，碳纤维刷作为阳极材料，BES反应器如图 1所示.实验组选取已连续运行了2年左右、性能稳定的阳极生物膜，阳极电位可以达到标准的-500 mmol/L (vs SCE)；对照组采用电位处于400 mV左右的阳极生物膜，其被认为已经丧失了电化学活性.将附有生物膜的阳极碳刷放置于装有50 mmol/L PBS的离心管中，高速震荡10 min，取上清10 000 g离心10 min，去上清，沉淀即为生物膜.DNA的提取采用 PowerSoil DNA提取试剂盒 (MOBIO公司生产),利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA.

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图 1 单室BES反应器示意图 Fig. 1 Schematic diagram of single-chamber BES reactor

利用高通量测序仪器Roche 454 FLX 为测序平台.首先进行PCR反应，引物为细菌16 S rDNA引物：27F，5’AGAGTTTGATCCTGGCTC AG3’; 533R，5’TTACCGCGGCTGCTGGC AC3’，553R作为测序端.PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，2%琼脂糖电泳检测.将PCR产物用QuantiFluor^TM -ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，进行相应比例的混合以利于测序量要求.

通过高通量测序，实验组最终读取了10 862 个高质量片段，对照组读取了12 254个高质量片段.经过开放读码框OTU聚类，实验组的片段可以聚类为846个OTU，而对照组则可以聚类为984个OTU.这说明对照组的细菌群落丰度要高于实验组，Ace和Chao1指数的推测也表明了该结果的准确性.对于群落的多样性，实验组的shannon指数(3.76)要低于对照组的shannon指数(4.08)，说明实验组的多样性要低于对照组，simpson指数也表明了这个结果(表 1).综上看来，无论是群落的丰度，还是群落的多样性，实验组都要略微低于对照组.这个结果的出现可以在一定程度上表明具有良好电化学活性的生物膜因为其功能以胞外传递电子为主，所以汇聚了大部分的电化学活性细菌，因此群落多样性相对单一；而丧失了电化学活性的生物膜，因为电化学活性细菌所占比重降低，而其他一些没有电化学活性的细菌占据了生物膜的一部分空间，导致胞外电子传递不通畅，虽然其丰度和多样性都比较高，但其发挥的作用却没有得到体现.

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 阳极生物膜细菌群落丰度和多样性指数 Table 1 Abundance and diversity index of bacterial communities from anode biofilm 组名 Reads OTU Ace Chao1 shannon simpson coverage 实验组 10 862 846 1 929 1 432 3.76 0.089 9 0.960 965 对照组 12 254 984 2 339 1 752 4.08 0.079 8 0.958 871

表 1 阳极生物膜细菌群落丰度和多样性指数 Table 1 Abundance and diversity index of bacterial communities from anode biofilm

稀释性曲线用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理.采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构成该曲线.如图 2所示，当序列数超过10 000时，曲线趋向平坦，说明本次测序数据量合理，如果接着读取序列，更多的数据量只会产生少量新的OTU，造成测序资源浪费.从稀释曲线中也可以看到，经过耐毒性驯化的阳极生物膜其 OTU数量要低于驯化之前，与之前的群落多样性的各项指数变化相一致.

图 2(Figure 2)

Fig. 2

图 2 高通量测序中实验组和对照组的 细菌群落稀释曲线 Fig. 2 Rarefaction curves of bacterial communities for experimental group and matched group based on high-throughput sequencing

在实验组的846个和对照组的984个OTU中，二者共同拥有的OTU个数为410个，占总 OTU个数的28.9%，说明二者的群落构成大不相同.为了进一步鉴定二者群落的多样性，本文分别 从门、纲和属3个分类学水平去分析.实验组和对照组的生物膜在一定程度上展现出了相似性，但是在具体的个别构成单元中差异比较明显.

首先从门分类学水平来分析,如图 3a所示，二者主要组成部分由7个门的细菌构成，其中，Proteobacteria占支配地位(实验组68%，对照组63%)，这部分与之前Lu等的研究一致^[5]；其次为Synergistetes门(实验组16%，对照组12%)、Bacteroidetes门(实验组6%，对照组3%)，这两个门和Lu等的研究有着很大差别，Synergistetes门并没有被发现或者其所占数量比例非常小，Bacteroidetes门的细菌所占数量比例却为30%以上，这种差异的产生除了和接种物的选择相关之外，另一个可能是和BES的功能相关.本实验的BES被用于高浓度染料废水脱色，其中染料废水具有生物毒性，这种毒性会影响某些耐受性弱的细菌的生存，而Lu等的BES主要用于生产氢气，并不涉及高浓度的毒性污染物.所以推测从接种物的选择和BES的功能都会对阳极生物膜的构成产生影响.在实验组和对照组比较过程中发现，所占数量比例差别最为明显的是Actinobacteria门(放线菌) (实验组0.5%，对照组7%)，在先前的各种报道中还未发现放线菌的电化学活性的报道，对照组电化学活性是否和放线菌的数量比例过大有关还未可知，但是不具有胞外电子传递的细菌如果占据阳极碳刷的表面积过大，必然会导致电极的电化学活性的衰退.

图 3(Figure 3)

Fig. 3

图 3 阳极生物膜细菌群落的系统分类鉴定 Fig. 3 Taxonomic classification identification of bacterial communities from anode biofilms(a)—门分类水平； (b)—纲分类水平.

从纲分类学水平的分析显示，如图 3b所示，电化学活性生物膜中占支配地位的依次为Deltaproteobacteria (51%)，Synergistia(16%)，Betaproteobacteria(16%).与实验组相比较，具有明显变化的细菌纲仍然为放线菌门下属的还未有分类学信息的纲(no rank Actinobacteria)，这与上述的门分类学水平相对一致.此外差异较大的为Clostridia纲和Anaerolineae纲.

门和纲的分类学水平相对较高，包含的物种数量较多，相对来说比较粗放，属分类学水平的分析则精细很多.从属水平的 分析可以更好地从细菌功能的角度来解释阳极生物膜群落的构成(见表 2).无论是在实验组还是对照组，Geobacter属同时占据着优势地位，其所占数量比例分别为28.9%和29.7%.关于Geobacter属的研究已经非常广泛，存在于该细菌表面的细胞色素酶类具有胞外传递电子的能力已经被大家所认同，尤其是该属中的Geobacter sulfurreducens作为一株模式产电菌，其产电能力也被广泛研究，无论是在MFC，还是MEC中，在由混菌构成的生物阳极群落中，其所占数量比例的优势地位已经得到了很多验证，最高数量比例可以达到80%以上^[6].虽然对照组的电化学活性缺失，但是Geobacter仍占据优势地位，一些没有分类学信息、功能未知的细菌极有可能参与了抑制电化学活性发挥的过程，尤其要注意到对照组中存在着一定量的放线菌，其很可能产生低浓度的抗生素，虽然没有杀死产电细菌，但是对其活性产生抑制作用.

Thauera属可以利用多种有机底物进行生存，并具备固氮作用，很多关于MFC阳极的研究中被检测并报道^[7]，但是其具体是否具有产电功能还未见报道.在Mardanpour等开发的螺旋式阳极MFC中，利用乳制品废水进行产电，Thauera属细菌可以占到阳极生物膜的17%左右^[8]，如此高的数量比例预示着其作用不可忽视，虽然没有其能够直接向电极传递电子的证据，或许它可能对产电菌具有协同促进作用.

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 阳极生物膜在属分类水平上的 细菌群落分布 Table 2 Taxonomic classification of bacterial communities from anode biofilms at genus % 菌属名称 实验组 对照组 Geobacter 28.9 29.7 Thermovirga 15.9 11.9 Thauera 4.4 4.7 Syntrophorhabdus 2.1 0.8 Syntrophomonas 1.1 3.0 Comamonas 1.0 0.4 Leptolinea 0.5 1.2 Fusibacter 0.5 0.9 Anaerolinea 0.4 1.0 Rhodopseudomonas 0.4 1.1 Bellilinea 1.0 0.4 Acinetobacter 0.01 2.2

表 2 阳极生物膜在属分类水平上的 细菌群落分布 Table 2 Taxonomic classification of bacterial communities from anode biofilms at genus

在关于Syntrophorhabdus 和Syntrophomonas属的研究中，有研究认为其可以进行氢气和乙酸盐之间的转换^[9]，考虑到本研究的BES中使用的是乙酸盐作为电子供体，并且单室BES的阴极在低电位的条件下可能存在析氢副反应，所以氢气和乙酸盐间的转换在理论上是可能的.

在其他检测到的非优势菌属中，Comamonas属也在阳极生物膜群落中被发现，其分离的纯菌具有产电能力已经被证实^[10].Rhodopseudomonas在阳极生物膜中被发现其可以存在^[11]，虽然所占数量比例很小，但该菌属具有光合器官，可以直接从阳光中摄取能量，对该菌属的深入研究表明，可以辅助一些细菌进行产电的同时，具备从乙酸盐中摄取电子并将其传递至电极的能力.

虽然从属水平分析可以有效地去判断菌属的功能，但是其缺点是存在大量的未能分类到属水平的细菌，这些细菌虽然能够被高通量测序技术检测出来，但是分类学信息缺乏，一些不能分离培养的细菌也会包含在内.挖掘这些细菌个体的具体功能，仍然需要今后进行深入的研究分析.

1) 通过高通量测序技术可以高效率地获取电化学生物膜的群落结构信息，其序列覆盖率达到95%以上，大量的OTU序列被发现.

2) 从门和纲的分类学水平分析发现，放线菌门细菌在电化学生物膜中所占数量比例极低，为0.5%，而在对照组中含量却高达7%，这个差异的影响有待深入验证.

3) 从属分类学水平的分析发现，具有电化学活性的Geobacter属细菌在实验组和对照组的生物膜群落构成中占着统治地位，数量比例接近30%，电化学活性的缺失和Geobacter属所占数量比例大小没有直接关系.